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Chromatine et
réparation de l’ADN
Chromatin and DNA repair
Responsable
: Gaëlle LEGUBE
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Gaëlle LEGUBE, CR2-CNRS
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Pierre CARON, Doctorant
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Béatrix BUGLER, CR1-CNRS
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François AYMARD, Doctorant
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Virginie DABURON, TCN-CNRS
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Jonathan
CHOUDJAYE, M2R
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Emmanuelle GUILLOU, Post-Doc
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Les
lésions double-brins de l’ADN (DSBs) représentent un danger important
pour la cellule, puisqu’elles peuvent conduire à des mutations et des
réarrangements chromosomiques. Les cellules eucaryotes ont alors
développé des processus de réparation efficaces (HR et NHEJ) pour faire
face à ce type de lésions. Cependant l’organisation de l’ADN en
chromatine complique la réparation des DSBs. L’implication de la
structure de la chromatine et les remodelages qui accompagnent les
processus de réparation restent à ce jour mal compris, faute d’un système
modèle pratique.
Nous
avons établi un nouvel outil expérimental qui permet d’induire de façon
contrôlée plusieurs lésions séquences spécifiques dans les cellules
mammifères. Ce système est basé sur l’utilisation d’une enzyme de
restriction, couplée au domaine de liaison au ligand du récepteur aux
œstrogènes, qui permet de contrôler la localisation nucléaire de l’enzyme
de restriction, et donc l’induction des DSBs. Ce système novateur nous
permet à présent d’utiliser la ChIP-chip, technique de pointe pour l’étude
de la chromatine « genome wide » in
vivo (qui permet d’étudier, à l’échelle du génome et à haute
résolution, l’interaction des protéines avec l’ADN). Bien que récente,
elle a été utilisée de façon extensive dans l’étude des déterminants
épigénétiques de la transcription. En revanche, son utilisation dans
l’étude de la réparation est sans précédent.
La
modification de la chromatine la
mieux connue comme étant associée aux processus de réparation des DSBs
est la phosphorylation du variant H2AX de l’histone H2A (gH2AX), incorporée
dans 10-15 % des nucléosomes chez les mammifères. En réponse aux
DSBs gH2AX
est induite de façon rapide sur plusieurs mégabases de chromatine autour
des lésions. Cependant,
on ne connaît pas les déterminants qui contrôlent la propagation de gH2AX. Nous avons d’ors et déjà réalisé des
ChIP-chip gH2AX afin d’étudier ces mécanismes de
propagation. Le traitement à l’OHTAM conduit à la détection de larges
domaines (0.3 à 2MB) enrichis en gH2AX (Fig1). gH2AX s’étend de façon bidirectionnelle mais
pas toujours symétriquement autour des sites de clivage, indiquant
l’existence d’éléments barrières, qui limitent la propagation de gH2AX (séquences d’ADN ou/et structure de la
chromatine). De plus la propagation de gH2AX à l’intérieur des domaines est
hautement discontinue (manuscrit soumis).
En collaboration avec J.S Iacovoni, INSERM U858, nous travaillons
actuellement sur la caractérisation des déterminants qui influencent la
propagation de gH2AX (corrélation du profil de gH2AX avec des caractères génomiques et
épigénétiques variés).
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Maintaining genome integrity
is of crucial importance for multicellular organisms. This is illustrated
by the variety of human diseases, associated with DNA repair defects.
Over the past few years it has become evident that chromatin, being the
real substrate for DNA related processes, plays a decisive role in DNA
repair. Therefore, understanding how DNA repair is affected by chromatin
structure is an outstanding challenge nowadays.
While ChIP-chip is a powerful technique to provide high-resolution maps
of protein-genome interactions, its use to study DNA Double Strand Break
(DSB) repair has been hindered by the limitations of the available damage
induction methods. Indeed, genotoxic drugs or radiation, usually
used to generate DSBs, induce breaks at random positions throughout the
genome, which are not suitable for subsequent ChIP analyses. Whereas few
systems have been developed to induce localized DSBs in yeast or
mammalian cells, none of them allows precise investigations of several
breaks located in various chromatin contexts.
We have developed a new experimental
system, based on the use of a restriction enzyme fused to the ligand
binding domain of the oestrogen receptor that generate multiples sequence-specific and
unambiguously positioned DSBs across the genome. This novel cell line provides now a powerful and unique tool to study
specific chromatin changes and function during the repair of DSBs, as it
enables high resolution
profiling of any DSB induced chromatin modification and DNA repair
complexes around breaks. Using this system, we have already established the first high
resolution map of a DSB-induced chromatin modification (gH2AX), and have investigated its spreading
properties. With such a
system in hands we now want to address some yet uncovered although
crucial aspects of DSB repair in the context of the chromatin.
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Figure 1:
Distribution de gH2AX après induction des DSBs par AsiSI-ER.
ChIP-chip réalisées sur des cellules U20S-ER-AsiSI avant et
après traitement à l’OHTAM, avec des anticorps dirigés contre gH2AX et H2AX. Les ChIP sont
hybridées sur puces Affymetrix
HumanTilling Array 2.0R, couvrant les chromosomes 1 and 6. Les sites
enrichis en gH2AX/H2AX ont été identifiés
(threshold log2ratio =0.515, max gap=500, min run=0) en utilisant TAS
(Tilling Array Software, Affymetrix). La densité des sites enrichis en gH2AX est représentée le long des chromosomes 1 et 6, en absence (en bleu) ou en
présence (en rouge) d’OH-TAM.
Publications :
Caron P, Aymard F, Iacovoni
J.S, Briois S. Canitrot Y, Bugler B , Massip L,
Losada A, and Legube G. Cohesin protects genes against
gH2AX induced by DNA Double Strand Breaks PLoS Genet.
2012 Jan;8(1):e1002460. Epub 2012 Jan 19.
Gospodinov
A, Vaissiere T, Krastev DB, Legube G, Anachkova B, Herceg Z. Mammalian Ino80 mediates double-strand break repair
through its role in DNA end strand resection.Mol Cell Biol.
2011 Dec;31(23):4735-45. Epub 2011 Sep 26.
Massip L, Caron P, Iacovoni
J.S, Trouche D, and Legube G. Deciphering Chromatin Landscape around DNA
Double Strand Breaks, Cell Cycle, 2010 Aug 20;9(15)
Iacovoni J.S#,
Caron P#, Lassadi I, Nicolas E, Massip L, Trouche D§,
and Legube G*§. High resolution profiling of gH2AX around DNA
Double Strand breaks in the mammalian genome. EMBO J, 2010 Apr 21 29(8):1446-57 (* corresponding
author, § co-authors, # co-authors)
Miller K, Tjeertes J,
Coates J, Legube G, Polo S.E., Britton S, and Jackson S.P. Human HDAC1
and HDAC2 function in the DNA-damage response to promote DNA
non-homologous end-joining. Nat Struct Mol Biol. 2010 Sep;17(9)
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